DNA损伤慧星实验是我们实验室基于实践经验,总结出便捷实验。不仅提供配置好的试剂盒,还提供实验检测服务,也可以提供技术培训!欢迎大家来电咨询!
实验步骤 1、新鲜收集的细胞用冰冷的PBS洗一次,离心收集,PBS重悬使其密度为1x106个/mL;
2、铺胶:下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制,第1层凝胶的制备:取干净的载玻片,滴加100ul 45℃预热的0.5%正常熔点琼脂糖,加22×22mm盖玻片,4℃放置3 min,待胶凝固后,推去盖玻片,于60℃烘箱烤30min,直至胶完全干透,此时片子可室温干燥条件下密封保存一周。第2层凝胶的制备:取已铺好第一层胶的玻片,将10μL细胞(约104个)和75μL 37℃预热的0.7%低溶点琼脂糖混合均匀。迅速将含细胞的琼脂糖滴到第1层琼脂糖上,立即盖上另一干净盖玻片(22×22mm),置4℃2min使第2层LMA凝固。第3层凝胶的制备:第2层凝固后,在室温下小心移去盖玻片,滴加预热37℃的75μL的0.7%低溶点琼脂糖,如上盖上盖玻片(22×22mm),4℃下凝固2 min。
3、细胞裂解移去盖玻片,将玻片置于平皿中,倒入预冷的细胞裂解液(使用前每9mL加入1mL的DMSO),4℃裂解1~2h,取出载玻片用PBS漂洗。
4、DNA碱解旋将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液,约覆过载玻片胶面0.25cm左右,室温放置20~60min,以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段,使DNA断链在电场中易于迁移。
5、单细胞电泳在电压25V下,电泳20-30 min。
6、中和电泳后将载玻片置于平皿内。加入中和缓冲液,将载玻片没入,4℃中和三次,每次10min,弃去Tris-HCl缓冲液。
7、脱水干燥 将片子浸入无水乙醇中15min,重复两次,然后取出晾干,直至胶完全干透变薄,4℃下避光保存。
8、取出片子,滴加20 ul PI染液,盖上盖玻片,室温染色10 min,显微镜下观察拍照。
9、随机选择100个细胞,通过软件(如CASP)测量彗星头部直径和尾长,根据尾长和头部直径比值,估计DNA的损伤程度。 |