1、 新鲜收集的细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，PBS重悬使其密度为 1x10⁶个/mL；

  2、 铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用 PBS 配制，第 1 层凝胶的制备：取干净的载玻片，滴加100ul 45℃预热的0.5%正常熔点琼脂糖，加22×22mm盖玻片，4℃放置3 min,待胶凝固后，推去盖玻片，于60℃烘箱烤30min,直至胶完全干透，此时片子可室温干燥条件下密封保存一周。第 2 层凝胶的制备：取已铺好第一层胶的玻片，将 10μL细胞（约 10 ⁴个）和 75μL  37℃预热的 0.7%低溶点琼脂糖混合均匀。迅速将含细胞的琼脂糖滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片（22×22mm），置 4℃ 2 min 使第2 层 LMA 凝固。第 3 层凝胶的制备：第 2 层凝固后，在室温下小心移去盖玻片，滴加预热 37℃的75μL的 0.7%低溶点琼脂糖，如上盖上盖玻片(22×22mm),4℃下凝固2 min。

3、 细胞裂解 移去盖玻片，将玻片置于平皿中，倒入预冷的细胞裂解液（使用前每 9mL加入 1mL 的 DMSO），4℃裂解 1~2h，取出载玻片用 PBS 漂洗。

4、 DNA碱解旋 将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液，约覆过载玻片胶面 0.25cm 左右，室温放置 20~60min,以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。

5、 单细胞电泳 在电压 25V下，电泳 20-30 min。

6、 中和 电泳后将载玻片置于平皿内。加入中和缓冲液，将载玻片没入，4℃中和三次，每次 10min，弃去 Tris-HCl 缓冲液。

7、 脱水干燥  将片子浸入无水乙醇中15min，重复两次，然后取出晾干，直至胶完全干透变薄，4℃下避光保存。

8、 取出片子，滴加20 ul PI染液，盖上盖玻片，室温染色10 min，显微镜下观察拍照。

9、 随机选择100个细胞，通过软件（如CASP）测量彗星头部直径和尾长，根据尾长和头部直径比值，估计DNA的损伤程度。