1试剂及材料
PBS、4%多聚甲醛、3%H2O2、EDTA修复液、10%山羊血清(或3%BSA)、通用二抗鼠/兔二抗检测系统试剂盒、苏木素染色液
2实验步骤
(1)标本固定
a细胞爬片
吸去培养皿中的培养液,用PBS洗涤,洗3次;吸净PBS,加入4%多聚甲醛,固定20min,PBS洗涤,洗3次;
b新鲜组织
将组织完全浸泡在4%多聚甲醛中,常温下固定24h,石蜡包埋切片。
(2)烤片
72℃烘箱烤2h;
(3)脱蜡、水化
①二甲苯替代品,3次,每次5min;
②梯度酒精:100%、95%、75%、50%、蒸馏水各3min
(4)灭酶
37℃、3%H2O2浸泡10min,PBS洗涤2次,2min/次。
(5)修复:(甲醛固定,使内源性物质形成醛键、羟甲键而封闭了部分抗原决定簇,蛋白之间交联而使抗原决定簇隐蔽)
① 微波加热EDTA修复液,至其沸腾;
② 将玻片放入修复液中,调火力至4,微波修复15min。
③ 自然冷却至室温。(注:玻片上的组织从开始修复至溶液冷却到室温,应一起泡在修复液中)
④PBS洗涤,3次,5min/次。
(6)封闭
用10%的山羊血清或3%的小牛血清封片室温30min。
(7)孵育一抗
用封闭液稀释抗体,4℃过夜;PBS洗涤,3次,5min/次
(8)孵育二抗
取通用二抗检测系统试剂盒中的A液,滴加在标本上,将玻片放入湿盒,室温孵育40min,PBS洗片,3次,每次10min,甩尽玻片上的水滴,平放于湿盒中。
(9)DAB显色和苏木素复染
滴加预备好的显色剂DAB工作液约50μL,室温孵育5~10min,显微镜下观察显色情况,显色结果后用蒸馏水冲洗玻片,终止显色。
苏木精复染5-10min。(如染色过深,可用盐酸酒精分化)
(10)封片
1×PBS | 10%山羊血清封闭液 | ||
NaCl | 8.0g | 山羊血清 | 10ml |
KCl | 2.0g | PBS | 90ml |
Na2HPO4 | 1.44g | 3%BSA封闭液 | |
KH2PO4 | 0.25g | 牛血清白蛋白(BSA) | 3g |
用超纯水溶解,定容至1000ml | PBS | 100ml | |
4%多聚甲醛(4%PFA) | 0.5M EDTA修复液(50×储存液) | ||
多聚甲醛(粉末) | 40g | EDTA·2H2O | 181.6g |
0.5M Na2HPO4( pH 7.4) | 200ml | 用800ml蒸馏水溶解EDTA粉末,用NaOH | |
0.1% DEPC H2O | 800ml | 粉末调pH调至8.0,再定容至1000ml。 | |
水浴加热到70°C,然后加入40g多聚甲醛, | 分化液 | ||
搅拌至完全溶解。 | 75%乙醇 | 49.5ml | |
EDTA修复液(工作液) | 浓盐酸 | 0.5ml | |
0.5M EDTA修复液 | 20ml | ||
蒸馏水 | 980ml |
3常见的问题及可能原因分析:
问题 | 可能原因 | 验证或解决方法 |
染色过强 | 一抗的浓度过高 | 降低一抗浓度 |
孵育时间过长 | 一抗孵育的时间为4℃过夜或37℃1h | |
C液或D液孵育时间过长 | C液或D液孵育时间不得超过10min | |
DAB显色时间过长或DAB浓度过高 | 显色时间不能超过5-10Min,以显微镜下为准 | |
非特异性背景染色 | 操作过程中冲洗不充分 | 每步冲洗3次,每次5min |
血清蛋白封闭不充分 | 延长血清蛋白封闭时间 | |
组织中所含过氧化物酶未阻断 | 用新鲜3%H2O2封闭,封闭时间延长 | |
组织切片折叠 | 勿以折叠处观察染色结果 | |
加试剂后切片干燥 | 防止切片干燥(必要时重做) | |
染色弱 | 抗体浓度过低或孵育时间短 | 增加抗体浓度,孵育时间不低于60min |
试剂超过有效使用期 | 及时更换试剂 | |
操作中,滴加试剂时缓冲液未沥干,致使试剂稀释 | 每步滴加试剂前甩干片中的缓冲试剂 | |
室温太低 | 延长孵育时间 | |
蛋白封闭时间太长 | 封闭时间不要超过30min | |
染色阴性 | 操作发生错误 | 重新试验,设立阳性对照 |
组织中无抗原 | 设立阳性对照,以验证试验结果 | |
一抗与二抗种属连接错误 | 确定一抗和二抗种属无误 |