骨髓染色体标本制备通常用于白血病患者,特别是急慢性粒细胞的白血病的检查,也 适 用于淋巴细胞性白血病。骨髓细胞处于生长分裂期,可以直接取样制备染色体标本片,为了增加细胞的分裂相数量,可在加入秋水仙素的培养液中作短暂的培养。再收集细胞制备染色体标本片,会获得较满意的分裂相数目。
1.骨髓细胞短期培养法
1.1培养液配方:RPMI 1640 80%
小牛血清 20%
双抗 100单位/毫升
肝素 100单位
配好后分装成每瓶5毫升,冰冻保存,用灭菌的注射器从髓骨抽取骨髓液0.2-0.4毫升,直接注入预热37℃的培养液中摇匀,37℃培养24-48小时后,加入秋仙素(10微克/毫升)0.1毫升,继续培养4-6小时,终止培养收集细胞。
1.2低渗处理
将培养物倒入10毫升的刻度离心管内,平衡离心、离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟。小心吸去上清,加入8毫升预热37℃的低渗液,用吸管将现溶物打匀,置37℃水浴15-20分钟。使白细胞膨胀,染色体分散,红细胞解体。
1.3预固定
低渗后,立即加入1毫升新配的固定液,轻轻打匀,1000-1500转/分,离心8-10分钟。
1.4固定
离心后弃上清,留下管底的细胞,缓慢加入固定液约8毫升并轻轻打匀,37℃水浴30分钟;第一次固定时,先加数滴,轻轻将细胞打匀,再慢慢加至8毫升,打匀,这样染色体标本的形态较好。1000-1500转/分,离心8-10分钟。
1.4再固定
离心后,弃上清,加入8毫升固定液,打匀。于37℃水浴30分钟,平衡离心、离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟。
1.5制片
离心后,弃上清,根据沉淀的细胞量,加入适量的固定液打匀,将细胞悬液滴入1-2滴于预冻的干净玻片中央,随即吹气,轻轻过火,空气晾干。
2.骨髓细胞直接制片法
用灭菌的注射器从隋骨抽取骨髓液0.3-0.5毫升,立即注入含秋仙素0.1-0.05微克/毫升的生理盐水(5毫升)中,用滴管轻轻吸动,将骨髓的脂肪颗粒充分洗掉,平衡离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟,弃上清。加入含同样秋水仙素浓度的生理盐水2-3毫升,37℃放置2-3小时,平衡离心,时间速度同上,弃上清。加低渗液5毫升,打匀后37℃水浴10-15分钟,离心弃上清,固定、制片的方法按外周血染色体标本制备进行。
3.注意事项
(1)骨髓染色体标片制备的成败,首先取决于骨髓液,抽取骨髓太少或太稀,细胞数量过少,不易获得较多的中期细胞,要进行核型分析就更困难了。故要足够的骨髓量和细胞数。细胞数量要求达3×106/毫升。通常作短期培养能增加细胞数目,提高成功率。
(2)骨髓材料中脂肪颗粒较多,必须充分洗掉,否则影响标片的质量。