摘要:聚合酶链式反应在医学生物的研究领域中已经得到了广泛的应用,并且被广泛应用到临床诊断,本研究主要主要通过多重PCR技术检测对不孕患者的Y染色体上的基因微缺失片段的病例进行分析。
关键词:多重PCR、男性不孕、Y染色体微缺失
PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,又称多聚合酶链式反应、基因的体外扩增法、无细胞克隆技术等。这是一种在生物体细胞外通过酶合成特异DNA或DNA片段的方法。利用此方法,能使及其微量的目的基因或某一特定的DNA片段在几个小时后迅速扩增数百万倍,且无需通过繁琐费时的基因克隆程序,便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。
PCR技术由三个步骤反复的热循环构成:高温变性、低温退火和适温延伸。高温变性:在高温(95℃)条件下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;低温退火,在低温(55℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;适温延伸即在特异耐热——Taq DNA聚合酶的最适温度(72℃)时,引物3’端合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成新的DNA链。新合成的DNA双链又可以作为扩增模板,反复进行解链、退火、延伸三个步骤的热循环,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增10n倍以上,实际上可达106~107倍。
基于PCR技术的基本原理,多种新的应用模式应运而生,使PCR技术不断得在改善,出现了更多新的技术,如多重PCR、标记PCR、免疫PCR、原位PCR等,使PCR技术具有更广的应用潜力。
1、材料与试剂
基因组DNA提取试剂盒、GoTaq Master Mix (Promega M712B)、MgCl2溶液、琼脂糖粉末、0.5×TBE、北京六一电泳仪、水平电泳槽、引物
Sy84 Forward primer(5'-3'):AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT
Reverse primer(5'-3'):GCCTACTACCTGGAGGCTTC
Sy86 Forward primer(5'-3'):GTGACACACAGACTATGCTTC
Reverse primer(5'-3'):ACACACAGAGGGACAACCCT
Sy127 Forward primer(5'-3'):GGCTCACAAACGAAAAGAAA
Reverse primer(5'-3'):CTGCAGGCAGTAATAAGGGA
Sy134 Forward primer(5'-3'):GTCTGCCTCACCATAAAACG
Reverse primer(5'-3'):ACCACTGCCAAAACTTTCAA
Sy254 Forward primer(5'-3'):GGGTGTTACCAGAAGGCAAA
Reverse primer(5'-3'):GAACCGTATCTACCAAAGCAGC
Sy255 Forward primer(5'-3'):GTTACAGGATTCGGCGTGAT
Reverse primer(5'-3'):CTCGTCATGTGCAGCCAC
2、实验步骤
2.1 PCR
PCR反应体系 | | | PCR反应条件 | ||
Nuclease-free Water | 6.5μl | | 95℃ | 5min | |
2×GoTaq Master Mix | 12.5μl | | 95℃ | 45sec | 35cycle |
Forward Primer(10μM) | 1μl | | 56℃ | 45sec | |
Reverse Primer(10μM) | 1μl | | 72℃ | 45sec | |
DNA Template | 4μl | | 72℃ | 10min | |
Total | 25μl | | | | |
多重PCR 反应体系 | | | 多重PCR反应条件 | ||
Nuclease-free Water | 4.5μl | | 95℃ | 7min | |
2×GoTaq Master Mix | 12.5μl | | 95℃ | 45sec | 35cycle |
Forward Primer1(10μM) | 1μl | | 56℃ | 45sec | |
Reverse Primer1(10μM) | 1μl | | 72℃ | 2min | |
Forward Primer2(10μM) | 1μl | | 72℃ | 10min | |
Reverse Primer2(10μM) | 1μl | | | | |
DNA Template | 4μl | | | | |
Total | 25μl | | | | |
2.2琼脂糖电泳
配2%凝胶:20ml 0.5×TBE+0.4g琼脂糖微波炉加热,加入2μl核酸染料,胶凝后取样品各5μl加于样孔,120V ,25min。
图示1 该电泳图显示正常男性标本:对照正常男性8个Y染色体上的基因
图示2 患者每条条带都检测出来,所以证实该男性初步诊断为正常男性
图示.3此图可看出此男性缺少多条条带:310bp、326bp、380bp、470bp,
所以该男性初步诊断为染色体部分缺失患者,可能是不孕的原因。
同时,该男性的染色体显示,该患者是异常男性(46XXY)。
图示.4通过多重PCR诊断染色体微缺失。上图可以看出,这个男性缺少380bp
和470bp这两条,所以该男性初步诊断为染色体部分缺失患者。
5、讨论
我们选取的染色体缺失片段位于Y染色体上,如下图所示:这些位点是欧盟不孕机构认可的位点。当然上有一些不常见的位点不包含在内。1-6代表不同位点,即不同的基因位置。