1.实验试剂、材料与仪器
试剂:1mol/L NaOH溶液、2×SSC/0.1%NP-40(洗液)、75%、85%、100%乙醇、变性液、DAPI、
材料:盖玻片、0.2ml PCR管、湿盒、
仪器:水浴锅、PCR仪、染缸、玻片盒、恒温培养箱、冰箱
2.实验步骤
(1)精子涂片
(2)精子核去凝集
划定杂交区域(约20×20 mm),滴加1mol/L NaOH覆盖杂交区,在显微镜下观察,直到精子头部是原来的2倍,且精子头部呈圆形,边缘清晰,约1.5-2min。2×SSC浸泡2min,洗去NaOH(后续实验须在pH7.0-8.0条件下进行,必须除去残留的NaOH);
(3)老化
2×SSC浸泡10min。
(4)脱水
依次在75%、85%、100%乙醇中浸泡2min,晾干。
将75%、85%、100%乙醇放入冰箱-20℃预冷,待变性后脱水用。
(5)变性
加入约20mlDNA变性液到玻片盒,水浴加热至77±2℃,轻轻将玻片放入玻片盒中,77±2℃变性5min,取出后马上依次放入预冷的75%、85%、100%乙醇各2min,晾干。
注意:必须等玻片的杂交区域完全干燥,再滴加探针。
以下步骤,注意避光
(6)探针准备
按每张片子6μl探针计,根据片子数量n,微量移液器取6×n μl探针至0.2ml PCR管,探针94℃变性4min,37℃平衡2min。
(7)杂交
平衡后的探针滴加在标本上,盖盖玻片,放入湿盒中,37℃-42℃杂交过夜。
(8)洗涤
将玻片移至已经预热至42℃的洗液中,浸泡5min,再移至常温的洗液,浸泡5min.
(9)复染
滴加20μl DAPI,盖盖玻片,暗处静置15min,荧光显微镜观察(先用低倍镜找到视野,再用100倍油镜观察)。