外显子生物-石蜡标本FISH玻片处理7.0版本
试剂准备:(外显子生物提供:原位杂交的所有探针、试剂、仪器)
1、蛋白酶K 25ml
A、10%SDS 120ul 96 86.4
B、 蛋白酶K 20mg/ml 250ul 200 180(使用前再加)
C、PBS 补齐至 25ml 20ml 18ml
2、PBS:PH7.0
3、二甲苯
4、100%、85% 、75%的酒精
5、变性液 :35ml甲酰胺,5ml 20*SSC (PH=7.0), 10ul 0.5M EDTA pH=7.0,10ml单蒸水,最后50ml pH=7.0-7.5 4℃保存,1个月使用有效。
6、20*SSC
7、洗液:2*SSC 含0.1%吐温-20(或者2*SSC/0.1%NP-40)
脱蜡处理:
1、老化:准备4-6μm厚度的石蜡切片,65℃2小时或70℃1小时以上烤片。
2、脱蜡:浸入新鲜二甲苯或二甲苯替代物(见货号:F-0025)10分钟,3次。
3、水化:然后100%酒精浸泡15分钟,95%, 5min;70%,5min;50% 5min;H2O 5min。晾干。
4、浸泡在1×SSC中80℃35分钟 或 用蒸馏水煮片子15分钟。
蛋白消化:
5、冲洗:用25mM Tris-Cl(PH7.4)包含5mM EDTA浸泡5分钟,1次。
6、蛋白酶K消化:37-47℃,5-10分钟, 温度升高,时间缩短,注意避免脱片。观察消化情况,关键步骤。或 选择0.1%胃蛋白酶(0.2M HCl溶解),37℃,34min。
7、4% FPA for 10 minutes at RT。PBS浸泡1次,5分钟。
8、平衡片子:去离子甲酰胺(50%)/2XSSC溶液(PH=7.0,用1M盐酸调节到PH=7)平衡4小时或过夜。
玻片变性:
11、变性液:77℃±2水浴平衡30分钟或用杂交仪。(注意温度:容器内和实际温度)
12、将玻片浸入4-6分钟,依据玻片的制备时间,每间隔1周增加2分钟。
13、梯度脱水:马上置入冰冷70%酒精3分钟,然后85%、100%酒精脱水,各1分钟。在45-50℃预热备用。
探针变性:以下步骤,探针注意避光
1、80℃变性5分钟,冰上放置,然后37℃平衡2分钟备用,建议用PCR仪。
2、将探针加在完全干燥的玻片上。
3、加盖玻片,Rubber cement胶封片。37-42℃过夜(12-18小时)。
共变性(有杂交仪,可以代替玻片变性和探针变性,合二为一):将探针加到玻片上,杂交仪84℃,5-8分钟
玻片洗涤:
1, 准备2XSSC洗液,37℃,浸泡5分钟。
2, 轻轻揭去玻片上的胶,如果不好揭开以及为避免干燥,继续放在洗液里面。
3, 2XSSC洗液。37℃,洗涤三次,10分钟每次。
4, 准备2XSSC洗液。1缸置于72℃,至少30分钟。
5, 72℃缸,洗涤2分钟;常温缸,洗涤2分钟。
6, 脱水,75%、85%、100%酒精,1分钟。空气干燥。
观察结果:
1、 加DAPI 20ul复染,加盖玻片。
2、 置于暗处20分钟,显微镜观察结果。
3、 结果,镜下观察需要考虑滤光片和显微镜调节,请仔细观察。(有些荧光眼睛看不到,需借助显微镜)。