热酚法抽提酵母tRNA方法探讨
作者屈奇奇钟欣超夏远梅
作者单位广州市外显子生物技术公司邮箱:focobio@126.com电话:020-89895006
实验目的:从酵母中提取tRNA用于制备封片剂材料
实验步骤:
(1)将酵母细胞培养在3ml选择性培养基中,30℃过夜旋转培养。
(2)稀释过夜培养的菌液,重新在10ml培养基中培养细胞。
(3)OD600达到1.0时,收菌,4000rpm/min离心5min,弃培养基。
(4)将菌体(或干酵母0.1g-0.05g)悬浮于400μl AE缓冲液(50 mM Sodium Acetate, 10mM EDTA,pH 5.2)。
(5)加入1/10体积的10% SDS,充分混合。
(6)加入等体积在65℃预热的酸性酚(pH4.5)(实验室里4℃的苯酚即可),混合。
(7)65℃加热5min,冰上放置10min。
(8)在室温下12000 rpm/min离心7-8min。
(9)取水相,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),12000rpm/min离心7min。
(10)取水相,加入等体积氯仿/异戊醇(49∶1)12000r/min离心7min
(11)取水相,加入1/10体积3M pH5.2的醋酸钠,2.5倍体积的无水乙醇,-20℃过夜沉淀。
(12)沉淀样品于4℃离心6 min,去除液体。
(13)沉淀中加入500ul冰冻1M NaCl,吹打沉淀1min,4℃12000 r/min,7 min,取上清。
(14)向第13步获取的上清中加入2倍体积的冰冻乙醇,-20°C保存2-4h,4℃12000 rpm / min离心,7 min,弃上清,取沉淀。
(15)加入500ul的0.3 M CH3COONa于第4步得到的沉淀中混匀,再加入0.54倍体积的异丙醇,室温下保存5-6 min,4℃12000 rpm/min离心,7 min,取上清。
(16)将第15步获得的上清中加入0.24体积的异丙醇,-20°C 2h以上(建议保存过夜),4°C 12000 rpm/min离心,7 min,弃上清。
(17)用1ml 75%乙醇洗涤沉淀,离心,去上清,开盖至乙醇挥发完。再加入适当体积的DEPC水溶解,-80°C保存。
讨论与注意事项分析:
1.第9、10步骤可直接合并为:使用酚/氯仿/异戊醇(125∶24∶1),12000r/min,7min,但效率与原方法不同,原方法效果高10%,亦可能是具体实验操作问题。
2.一次抽提效率:每60mg(0.06g)安琪牌活性干酵母,可得0.03mg,提取效率为0.05%。摇瓶菌体湿重0.5g一次抽提共得0.055mg,一管热酚上清分两管进行酚/氯仿/异丙醇抽提共得0.157mg (即一次实验菌体湿重不得超过0.3g,否则抽提效率下降),提取效率为0.03%
3.可通过增长离心时间、尽量多的吸取抽提的上清液、二次抽提废液和-20度过夜沉淀等进一步提高效率。
4.对于单次干酵母粉添加量超过0.1g是否能溶解、效率是否高尚未试验。
5.如有需要可对(13)(15)步抽提
材料与试剂:
1、AE缓冲液(50mM Sodium Acetate, 10mM EDTA):0.04g/10ml乙酸钠,0.03g/10ml EDTA,溶液pH大约为5.5,可不调。
2、3M pH5.2的醋酸钠:246g/L = 2.46g/10mL
3、1M NaCl:58.5g/L = 1.17g/20mL
4、0.3 M醋酸钠: 24.6g/L = 0.25g/10mL
货号 | 名称 | 规格 | 体积 | 价格 | 备注 |
QZZ-01 | 酵母tRNA | 10mg/mL | 50μl | 500元 |
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